非小細胞肺癌具有JI端的免疫多樣性！

在惡性腫瘤中，肺癌在全球發病率和死亡率位居前列，特別是非小細胞肺癌（NSCLC），占比高，且存在高度侵襲性、異質性，而且組織學亞型復雜和突變特征明顯。

腫瘤微環境的異質性在單細胞RNA測序（scRNA-seq）技術的進步下，也逐漸被解剖。但是單細胞RNA測序（scRNA-seq）存在樣本量有限，缺乏基因組數據和長期隨訪數據，因此在分析腫瘤微環境生物的異質性、藥物耐藥性等方面較為片面。

在NSCLC腫瘤微環境中，白細胞是重要的細胞類型，根據往期實驗數據得出：中性粒細胞在瘤內駐留白細胞中占比8%-20%。但是，單細胞RNA測序（scRNA-seq）在中性粒細胞方面的研究較少，因此，加強NSCLC 腫瘤微環境中中性粒細胞的研究，意義重大。

最近，奧地利因斯布魯克醫科大學的Zlatko Trajanoski和Andreas Pircher研究團隊在Cancer Cell發表題為《High-resolution single-cell atlas reveals diversity and plasticity of tissue-resident neutrophils in non-small cell lung cancer》的論文，研究發現：中性粒細胞（TRNs）亞群在NSCLC的腫瘤微環境中具有不同的功能特性，尤其是，TRNs的基因標記與免疫檢查點抑制劑治療的不良預后相關。

論文首頁截圖

該研究團隊根據公開的scRNA-seq數據集，對比自己團隊的NSCLC數據集（UKIM-V），根據大數據，進行全面的分析，整合出一個全新的NSCLC單細胞核心圖譜。在該圖譜中，轉錄組數據為298名(212名NSCLC患者,86名對照者),腫瘤樣本數據為364個（196個腫瘤樣本，168個非腫瘤）。在212名NSCLC患者中，肺腺癌（LUAD）為156人，占比73.6%；肺鱗狀細胞癌（LUSC）為41人，占比19.3%。

根據NSCLC核心圖譜的研究結果跟流式細胞分析數據一致,說明：中性粒細胞群僅占所有細胞的1.5%，但是圖譜里78%的中性粒細胞來自UKIM-V數據集，其中中性粒細胞分別占UKIM-V所有細胞的12%和所有白細胞的18%。中性粒細胞表達的mRNA分子量極低，發現是由于其半衰期較短，僅為7-10小時。對比多種測序結果發現，BD Rhapsody平臺捕獲的mRNA分子數量要豐富得多，因此可能更適合檢測低mRNA含量的細胞。

結合上述結果，該研究團隊利用BD Rhapsody平臺測序的UKIM-V隊列數據和中性粒細胞的轉錄組特征進行進一步研究，發現：LUSC中中性粒細胞比例明顯較高，而LUAD中巨噬細胞、CD4 T細胞、2型肺泡細胞、過渡型棒狀細胞/2型肺泡細胞（transitional club/AT2）更為豐富。

研究的總體流程和細胞類型

 根據患者腫瘤微環境浸潤模式，該研究團隊將NSCLC患者分為了四個類別：免疫荒漠型、B細胞優勢型、髓系細胞優勢型、T細胞優勢型。其中，免疫荒漠型沒有明顯的免疫細胞浸潤，但腫瘤細胞比例高；B細胞優勢型主要為B細胞、漿細胞和肥大細胞；髓系細胞優勢型主要為巨噬細胞和單核細胞；T細胞優勢型主要為CD8 T細胞、CD4 T細胞和調節性T細胞。不同免疫表型也表現出具有差異性的細胞因子信號特征。

不同腫瘤免疫表型的細胞因子信號特征

 根據早期的研究結果發現，LUAD以炎癥狀態為主，LUSC傷口愈合狀態為主。根據細胞-細胞通信網絡的差異，該研究團隊進一步實驗發現：LUAD以KDR（VEGFR2，血管內皮細胞生長因子受體2）-VEGFA（血管內皮生長因子A）通信上調為特征，通過促進血管生成，開啟免疫抑制信號，而LUSC則以SPP1（分泌型磷蛋白1）和JAG-NOTCH信號通路上調為主要特征，前者促進腫瘤轉移，后者通過募集中性粒細胞調節腫瘤免疫微環境。

細胞互作分析

 根據TCGA隊列數據的分析，發現轉錄組與生存數據之間的關系：腫瘤B細胞的富集度與NSCLC患者的良好預后成正相關，而中性粒細胞則呈負相關；而CD8 T細胞亞型的分析顯示，幼稚CD8 T細胞與良好預后呈正相關。

TCGA數據中細胞組成和生存率的關系

  根據對NSCLC中TRNs的異質性細胞亞群的鑒定發現：腫瘤相關中性粒細胞（TANs）和鄰近正常組織相關中性粒細胞（NANs）的表達譜特征不同，且中性粒細胞是腫瘤微環境中VEGFA的主要來源，印證了TRNs重要的促血管生成作用。

同時該研究團隊還發現：TANs中凝集素型氧化低密度脂蛋白受體1（LOX-1）表達升高，腫瘤組織中存在較多的LOX-1+細胞浸潤，但在匹配的相鄰的正常肺組織中未發現LOX-1+細胞浸潤，說明LOX-1可能是一種特異性的TANs標記物。

為了深入解析TRNs不同亞群的異質性，研究團隊繼續對圖譜中TRNs進行聚類分析，鑒定出了4個TAN亞群和3個NAN亞群。

值得注意的是，TAN-2亞群CD274（PD-L1）/PDCD1（PD-1）信號通路顯著上調，提示了TAN對CD8 T細胞的免疫抑制作用，這與過去報道的中性粒細胞的富集與抗PD-1/PD-L1治療無應答有關的結果一致。

為了確定TRNs在NSCLC患者中的預后價值，研究團隊分析NSCLC患者治療前腫瘤的RNA-seq數據，這些患者經歷了抗PD-L1抗體或化療藥單藥治療。結果顯示，TRN基因標記與抗PD-L1治療應答和生存預后呈明顯負相關（p=0.003），但在化療組中并不顯著。

TRN基因標記與免疫治療應答和預后的關

  綜上所述，這個研究從單細胞層面全面剖析了NSCLC腫瘤微環境，一方面，分析了中性粒細胞群對腫瘤微環境中具有不同功能特性的TRNs亞群進行深入表征，另外一方面，彌補了基因組數據以及長期隨訪數據，揭示了中性粒細胞與免疫治療抵抗和不良生存結局的關聯，為后續開發中性粒細胞耗竭劑奠定了基礎。

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