影響熒光原位雜交實驗的因素有哪些？

熒光原位雜交是一門新興的分子細胞遺傳學(xué)技術(shù)，是 20 世紀 80 年代末期在原有的放射性原位雜交技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種非放射性原位雜交技術(shù)。那么影響熒光原位雜交實驗的因素有哪些呢？讓我們一起來看看吧！

一、固定液的選擇及固定時間

①石蠟組織建議用10%中性緩沖福爾馬林固定12～48h，其它固定液對實驗結(jié)果可能產(chǎn)生一定的影響。

②組織標本離體后應(yīng)盡快固定，較大標本切開固定。如樣本固定不及時，熒光信號會減弱。（尤其環(huán)境溫度較高時更應(yīng)及時固定）

③固定液體積應(yīng)不少于標本體積的10倍，否則固定不充分，容易出現(xiàn)無信號或者信號很弱的現(xiàn)象。

④為了保證信號的準確性，蠟塊最好在2年內(nèi)進行檢測，已經(jīng)切好的切片在6周內(nèi)檢測最佳。

二、組織切片和載玻片的選擇

組織切片4～5μm厚，過厚或過薄的切片均會對信號的強弱產(chǎn)生影響，切片過厚將導(dǎo)致雜交不充分，最終信號點發(fā)生重疊，影響計數(shù)。而且切片應(yīng)完整，質(zhì)量良好，否則會在預(yù)處理時掉片。

載玻片的選擇建議使用防脫載玻片，有條件的實驗室可使用更好的陽離子或者陰離子專用載玻片，可有效防止脫片現(xiàn)象的發(fā)生。

三、切片的預(yù)處理

切片預(yù)處理過程包括煮沸處理和蛋白酶消化。

①當(dāng)組織處理不規(guī)范、切片過厚或烤片不足時，在煮沸過程中容易掉片，建議烤片溫度在56℃過夜。煮沸過程中要嚴格控制實驗溫度和時間。

②酶消化是FISH實驗的關(guān)鍵步驟之一，如果對組織不熟悉，可以先消化推薦的反應(yīng)時間，然后復(fù)染DAPI在熒光顯微鏡下觀察，在DAPI通道下，以細胞既無空洞(消化過度)，亦無明顯的云霧狀(消化不足)為最佳，同時可切換觀察紅綠通道，以紅綠通道無明顯的背景為佳，如果背景較高，可適當(dāng)延長消化時間。

③對于陳舊的石蠟組織切片，要適當(dāng)延長消化時間，否則會出現(xiàn)大量的自發(fā)熒光。

四、變性和雜交

變性和雜交是本實驗最關(guān)鍵的步驟，變性的時間和溫度是雜交成功是否的關(guān)鍵，變性和退火溫度對熒光信號影響較大，變性和退火溫度過低會導(dǎo)致雜交效率變低，使熒光信號變?nèi)酰冃院屯嘶饻囟冗^高易出現(xiàn)高背景。

為保證變性期間溫度的穩(wěn)定，建議采用專業(yè)的原位雜交儀進行變性和雜交步驟，不僅能夠減少實驗的繁瑣性，而且更有利于實驗條件的控制，比如時間、溫度和避光條件等。

為避免雜交液在變性和雜交過程中的損失和防止干片，一定要在蓋玻片的四周用橡膠水泥進行密封。

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